Νότια του Τεμένους βρίσκεται ένα από τα σημαντικότερα κτίρια του αρχαιολογικού χώρου της Παλαιόπολης, το Ιερό, στο εσωτερικό του οποίου γινόταν η μύηση στο δεύτερο βαθμό των Μυστηρίων, στην ανώτερη, δηλαδή βαθμίδα της μυήσεως, την Εποπτεία.
Το Ιερό άρχισε να κτίζεται κατά το τελευταίο τέταρτο του 4ου αιώνα π.χ. (γύρω στα 325 π.χ.) και φαίνεται πως αντικατέστησε δύο αρχαιότερες αψιδωτές οικοδομές, μία των αρχαϊκών χρόνων και μία του 5ου αιώνα π.χ. Η ολοκλήρωση της κατασκευής του Ιερού πραγματοποιήθηκε σχεδόν δύο αιώνες αργότερα, όταν προστέθηκε η δεκατετράστυλη δωρική πρόσοψη και ο γλυπτός διάκοσμος του αετώματος και των ακρωτηρίων (ανθεμωτή άκανθα στα κεντρικά και Νίκες στα γωνιακά). H κατασκευή του 4ου αιώνα π.χ. ίσως συνδέεται με το ενδιαφέρον του βασιλέα της Mακεδονίας Φιλίππου του B’ για το ιερό.
Πρόκειται για έναν ορθογώνιο, μακρόστενο, δωρικό ναό, με διαστάσεις 40 X 13 μ. και προσανατολισμό σχεδόν από Β προς Ν. Η πρόσταση αποτελείται από δύο σειρές με έξι κίονες, ανάμεσα στις οποίες μεσολαβούν πλευρικά δύο ακόμα κίονες. Το 1956 αναστηλώθηκαν πέντε κίονες και τα κεντρικά επιστύλια της πρόσοψης του Ιερού με την οικονομική υποστήριξη του Ιδρύματος Bollingen. Στην κατασκευή της θεμελίωσης και του κρηπιδώματος χρησιμοποιήθηκε κυρίως ο τοπικός πωρόλιθος, ενώ για την ανωδομή το θασίτικο μάρμαρο.
Στο βόρειο αέτωμα το πρωταρχικό θέμα του γλυπτού διακόσμου ήταν η ανατροφή του Αετίωνα με έμφαση στις ηρωικές μορφές που εγκαινίασαν τις τελετουργίες στη Σαμοθράκη, ενώ στο νότιο πιθανότατα υπήρχαν οι προτομές των μεγάλων Θεών. Ανάγλυφη διακόσμηση, που περιλάμβανε μορφές κενταύρων, διέθεταν και τα καλύμματα των φατνωμάτων της οροφής του πρόναου, ενώ ολόκληρο το κτίριο, που είχε δικλινή κεραμοσκεπή στέγη, περιέτρεχε δωρικός θριγκός.
Εκτός από την κύρια βόρεια είσοδο στο σηκό, στο εσωτερικό του Ιερού οδηγούσαν δύο είσοδοι, μια σε κάθε μακρά πλευρά του οικοδομήματος.
Στο εσωτερικό του ναού, το οποίο έφερε μαρμάρινο δάπεδο και επιχρισμένους τοίχους, υπήρχε, κατά μήκος των μακρών πλευρών, διπλή σειρά μαρμάρινων καθισμάτων που φιλοξενούσαν πιθανότατα παλιότερους επόπτες που παρακολουθούσαν τις τελετές. Στο κέντρο του βόρειου τμήματός του διατηρείται μικρή τετράγωνη εστία και μπροστά της ένα άνοιγμα σε μία πλίνθο, το οποίο χρησίμευε για την προσφορά σπονδών, ενώ το νότιο τμήμα του διαμορφώνεται εσωτερικά σε αψίδα που είχε ξύλινη οροφή.
Στην εξωτερική πλευρά του ανατολικού τοίχου του κτιρίου, δύο μαρμάρινα βάθρα, που περιβάλλονταν από κατακόρυφα τοποθετημένες κεραμίδες στέγης και πλαισιώναν βόρεια και νότια μία βάση πυρσού, συνδέονται πιθανότατα με την τελετή της εποπτείας.
